Spektrofotometri
Pengertian Dasar Spektrofotometer
Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Sedangkan peralatan yang digunakan dalam spektrofometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron yang ada pada atom ataupun molekul yang bersangkutan.
Sinar atau cahaya yang berasal dari sumber tertentu disebut juga sebagai radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik yang dijumpai dalam kehidupan sehari-hari adalah cahaya matahari. Radiasi elektromagnetik ini memiliki sifat ganda yang disebut sebagai sifat dualistik cahaya yaitu sebagai gelombang dan sebagai partikel-partikel energi yang disebut foton. Karena sifat tersebut maka beberapa parameter perlu diketahui misalnya panjang gelombang, frekuensi dan energi tiap foton. Hubungan dari ketiga parameter di atas dirumuskan oleh Planck yang dikenal dengan persamaan Planck.
Hubungan antara panjang gelombang frekuensi dapat dirumuskan sebagai
c = λ . v atau λ = c/v atau v = c/λ
Persamaan Planck: hubungan antara energi tiap foton dengan frekuensi
E = h . v
E = h . c/ λ
dimana
E = energi tiap foton
h = tetapan Planck (6,626 x 10-34 J.s),
v = frekuensi sinar
c = kecepatan cahaya (3 x 108 m.s-1).
Dari rumus di atas dapat diketahui bahwa energi dan frekuensi suatu foton akan berbanding terbalik dengan panjang gelombang tetapi energi yang dimiliki suatu foton akan berbanding lurus dengan frekuensinya. Misalnya energi yang dihasilkan cahaya UV lebih besar dari pada energi yang dihasilkan sinar tampak. Hal ini disebabkan UV memiliki panjang gelombang (λ) yang lebih pendek (100–400 nm) dibanding panjang gelombang yang dimiliki sinar tampak (400–800 nm).
Berbagai satuan energi beserta faktor konversinya dapat dilihat pada tabel:
Erg Joule Kalori l.atm E.volt
1 erg = 1 10-7 2,3901×10-8 9,8687×1010 6,2418×1011
J joule = 107 1 2,3901×10-1 9,8687×10-3 6,2418×1018
1 kalori 4,1849×107 4,1840 1 4,1291×10-2 2,6116×1019
1 atm = 1,0133×109
1,0133×102 24,218 1 16,6248×1020
1 E.volt = 1,6021×10-12 1,6021x-19 3,8291×10-20 1,5611×10-20
1
Interaksi antara materi dengan cahaya disini adalah terjadi penyerapan cahaya, baik cahaya Uv, Vis maupun Ir oleh materi sehingga spektrofotometri disebut juga sebagai spektroskopi absorbsi. Berdasarkan rentang panjang gelombang dimana suatu zat menyerap gelombang elektomagnetik, spektrofotometri dapat digolongkan menjadi:
1. Spektrofotometri Vis (Visible) dengan panjang gelombang: 400-800 nm.
2. Spektrofotometri UV (Ultra Violet) dengan panjang gelombang: 100-400 nm.
3. Spektrofotometri UV-Vis dengan panjang gelombang: 100-800 nm.
4. Spektrofotometri IR (Infra Red) dengan panjang gelombang: 300-25.000 nm dan tidak dibahas disini.
Selain 4 spektrofotometri ini masih terdapat beberapa spektroskopi absorbsi lain yakni: spektroskopi absorbsi sinar x, Spektroskopi Gelombang Mikro, Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti (NMR), Spektroskopi Resonansi Spin elektron (ESR) dan Spektroskopi “Photoacoustic” tetapi tidak dibahas pada artikel ini.
Dari 4 jenis spektrofotometri ini (UV, Vis, UV-Vis dan Ir) memiliki prinsip kerja yang sama yaitu “adanya interaksi antara materi dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu”. Perbedaannya terletak pada panjang gelombang yang digunakan. Instrumen dari keempat spektrofotometri inipun tidak berbeda, yakni terdiri dari:
Fungsi masing-masing bagian
1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan berbagai macam rentang panjang gelombang.
2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis. Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalan gratting atau lensa prisma dan filter optik. Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi spektrum cahaya. Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya yang diteruskan sesuai dengan warnya lensa yang dikenai cahaya.
3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel yang telah di masukan ke dalam kuvet yang terbuat dari kuarsa atau palstik.
4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi arus listrik.
5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang berasal dari detektor.
Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri
Di dalam suatu molekul yang memegang peranan penting adalah elektron valensi dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu materi. Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi), berputar (rotasi) dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi.
Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis) mengenai suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja yang akan diserap.
Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan elektron dari keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini disebut transisi elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya inframerah maka elektron yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada suatu molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi). Sedangkan gerakan berputar elektron terjadi pada energi yang lebih rendah lagi.
Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi suatu suatu yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel sampel disinari dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. ketika cahaya mengenai sampel sebagian akan diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian lagi akan diteruskan. Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang mengenai permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang dapat diukur adalah It/I0 atau I0/It. Proses penyerapan cahaya oleh suatu zat dapat digambarkan sebagai berikut:
Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang hamburkan diukur sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambert-beer atau Hukum Beer, berbunyi: jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan.
Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk menghitung banyaknya cahaya yang hanburkan:
dan absorbansi dinyatakan dengan rumus:
dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah intensitas cahaya setelah melewati sampel. Hukum beer dapat ditulis sbegai:
A= a . b . c atau A = ε . b . c
dimana:
A = absorbansi
b atau l = tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga umumnya 1 cm)
c = konsentrasi larutan yang diukur.
ε = tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam molar)
a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam ppm).
Secara eksperimen hukum Lambert-beer akan terpenuhi apabila peralatan yang digunakan memenuhi kriteria-kriteria berikut:
1. sinar yang masuk atau sinar yang mengenai sel sampel berupa sinar dengan dengan panjang gelombang tunggal (monokromatis).
2. Penyerapan sianr oleh suatu molekul yang ada di dalam larutan tidak dipengaruhi oleh molekul yang lain yang ada bersama dalam satu larutan.
3. Penyerapan terjadi di dalam volume larutan yang luas penampang (tebal kuvet) yang sama.
4. Penyerapan tidak menghasilkan pemancaran sinar pendafluor.
5. Indeks reflaksi larutan tidak tergantung pada konsentrasi. Dimana hukum lamber-beer tidak berlaku untuk larutan dengan konsentrasi tinggi.
Spektrofotometri sinar tampak (Visible)
Spektrofotometri visible disebut juga spektrofotometri sinar tampak. Yang dimaksud sinar tampak adalah sinar yang dapat dilihat oleh mata manusia. Cahaya yang dapat dilihat oleh mata manusia adalah cahaya dengan panjang gelombang 400-800 nm dan memiliki energi sebesar 299–149 kJ/mol.
Elektron pada keadaan normal atau berada pada kulit atom dengan energi terendah disebut keadaan dasar (ground-state). Energi yang dimiliki sinar tampak mampu membuat elektron tereksitasi dari keadaan dasar menuju kulit atom yang memiliki energi lebih tinggi atau menuju keadaan tereksitasi.
Cahaya yang diserap oleh suatu zat berbeda dengan cahaya yang ditangkap oleh mata manusia. Cahaya yang tampak atau cahaya yang dilihat dalam kehidupan sehari-hari disebut warna komplementer. Misalnya suatu zat akan berwarna orange bila menyerap warna biru dari spektrum sinar tampak dan suatu zat akan berwarna hitam bila menyerap semua warna yang terdapat pada spektrum sinar tampak. Untuk lebih jelasnya perhatikan tabel berikut.
Panjang gelombang (nm) Warna warna yang diserap Warna komplementer
400 – 435 Ungu Hijau kekuningan
435 – 480 Biru Kuning
480 – 490 Biru-kehijauan Jingga
490 – 500
Hijau kebiruan Merah
500 – 560 Hijau Ungu kemerahan
560 – 580 Hijau kekuningan Ungu
580 – 595 Kuning Biru
595 – 610 Jingga Biru kehijauan
610 – 800 Merah Hijau kebiruan
Pada spektrofotometer sinar tampak, sumber cahaya biasanya menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram. Wolfram merupakan salah satu unsur kimia, dalam tabel periodik unsur wolfram termasuk golongan unsur transisi tepatnya golongan VIB atau golongan 6 dengan simbol W dan nomor atom 74. Wolfram digunakan sebagai lampu pada spektrofotometri tidak terlepas dari sifatnya yang memiliki titik didih yang sangat tinggi yakni 5930 °C.
Panjang gelombang yang digunakan untuk melakukan analisis adalah panjang gelombang dimana suatu zat memberikan penyerapan paling tinggi yang disebut λmaks. Hal ini disebabkan jika pengukuran dilakukan pada panjang gelombang yang sama maka data yang diperoleh makin akurat atau kesalahan yang muncul makin kecil.
Berdasarkan hukum Beer absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi, karena b atau l harganya 1 cm dapat diabaikan dan ε merupakan suatu tetapan . Artinya konsentrasi makin tinggi maka absorbansi yang dihasilkan makin tinggi, begitupun sebaliknya konsentrasi makin rendah absorbansi yang dihasilkan makin rendah.
Hubungan antara absorbansi terhadap konsentrasi akan linear (A≈C) apabila nilai absorbansi larutan antara 0,2-0,8 (0,2 ≤ A ≥ 0,8) atau sering disebut sebagai daerah berlaku hukum Lambert-Beer. Kurva kalibarasi hubungan antara absorbansi versus konsentrasi dapat dilihat pada Gambar.
Gambar Kurva hubungan absorbansi vs konsentrasi
Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri sinar tampak adalah zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut harus tampak berwarna. Jika tidak berwarna maka larutan tersebut harus dijadikan berwarna dengan cara memberi reagen tertentu yang spesifik. Reagen ini disebut reagen pembentuk warna. Berikut adalah sifat-sifat yang harus dimiliki oleh reagen pembentuk warna:
1) Kestabilan dalam larutan. Pereaksi-pereaksi yang berubah sifatnya dalam waktu beberapa jam, dapat menyebabkan timbulnya semacam cendawan bila disimpan. Oleh sebab itu harus dibuat baru dan kurva kalibarasi yang baru harus dibuat saat setiap kali analisis.
2) Pembentukan warna yang dianalisis harus cepat.
3) Reaksi dengan komponen yang dianalisa harus berlangsung secara stoikiometrik.
4) Pereaksi tidak boleh menyerap cahaya dalam spektrum dimana dilakukan pengukuran.
5) Pereaksi harus selektif dan spesifik (khas) untuk komponen yang dianalisa, sehingga warna yang terjadi benar-benar merupakan ukuran bagi komponen tersebut saja.
6) Tidak boleh ada gangguan-gangguan dari komponen-komponen lain dalam larutan yang dapat mengubah zat pereaksi atau komponen komponen yang dianalisa menjadi suatu bentuk atau kompleks yang tidak berwarna, sehingga pembentukan warna yang dikehandaki tidak sempurna.
7) Pereaksi yang dipakai harus dapat menimbulkan hasil reaksi berwarna yang dikehendaki dengan komponen yang dianalisa, dalam pelarut yang dipakai.
Setelah larutan ditambahkan reagen atau zat pembentuk warna maka larutan tersebut harus memiliki lima sifat di bawah ini:
1) Kestabilan warna yang cukup lama guna memungkinkan pengukuran absorbansi dengan teliti. Ketidakstabilan, yang mengakibatkan menyusutnya warna larutan (fading), disebabkan oleh oksidasi oleh udara, penguraian secara fotokimia, pengaruh keasaman, suhu dan jenis pelarut. Namun kadang-kadang dengan mengubah kondisi larutan dapat diperoleh kestabilan yang lebih baik.
2) Warna larutan yang akan diukur harus mempunyai intensitas yang cukup tinggi (warna harus cukup tua) yang berarti bahwa absortivitas molarnya (ε) besar. Hal ini dapat dikontrol dengan mengubah pelarutnya. Dalam hal ini dengan memilih pereaksi yang memiliki kepekaan yang cukup tinggi.
3) Warna larutan yang diukur sebaiknya bebas daripada pengaruh variasi-variasi kecil kecil dalam nilai pH, suhu maupun kondisis-kondisi yang lain.
4) Hasil reaksi yang berwarna ini harus larut dalam pelarut yang dipakai.
5) Sitem yang berwarna ini harus memenuhi Hukum Lambert-Beer.
Spektrofotometri UV (ultraviolet)
Spektrofotometri UV dengan pangjang gelombang 100-400 nm. Sinar ultra violet terbagi menjadi dua jenis yaitu ultraviolet jauh dan ulta violet dekat. Ultraviolet jauh memiliki rentang panjang gelombang ± 10 nm-200 nm, sedangkan ultra violet dekat memiliki rentang panjang gelombang ± 200-380 nm. Cahaya UV tidak bisa dilihat oleh manusia, namun beberapa hewan, termasuk burung, reptil, dan serangga seperti lebah dapat melihat sinar pada panjang gelombang UV.
Pada spektrofotometer UV biasanya menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen sebagai sumber cahaya. Deuterium merupakan salah satu isotop hidrogen yang memeiliki 1 proton dan 1 neutron namun tidak memiliki. Deuterium berbeda dengan hidrogen yang hanya memiliki 1 neutron tanpa proton.
Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri UV adalah zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut tidak tampak berwarna. Jika zat tersebut berwarna maka perlu direaksikan dengan reagen tertentu sehingga dihasilkan suatu larutan tidak berwarna. Namun biasanya zat yang berwarna lebih banyak dianalisis menggunakan spektrofotometri sinar tampak.
Analisis menggunakan sir ultraviolet biasanya dilakukan menggunakan ultraviolet dekat, sedangkan analisis menggunakan ultraviolet jauh maka instrumen yang digunakan harus dalam keadaan vakum. Hal ini disebabkan jika digunakan ultraviolet jauh maka udara akan ikut menyerap panjang gelombang yang digunakan. Akbatnya kesalahan yang dilakukan makin fatal, karena jika udara ikut menyerap maka absorbansi yang dihasilkan akan makin besar, jika hal ini dihubungkan dengan hukum Lamber-Beer maka konsentrasi zat yang dianalisis lebih tinggi dari yang seharusnya.
Spektrofotometri UV-Vis
Sesuai dengan namanya spektrofotometer UV-Vis merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Pada spektrofotometer UV-Vis menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda yakni sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible.
Kini spektrofotometer yang digunakan hanya menggunakan satu lampu sebagai sumber cahaya. Lampu yang digunakan sebagai sumber cahaya yaitu photodiode yang telah dilengkapi monokromator. Monokromator disini berfungsi untuk mengubah cahaya yang berasal dari sumber cahaya sehingga diperoleh cahaya hanya dengan satu jenis panjang gelombang.
Zat yang dapat dianalisis dengan spektrofotometri UV-Vis yaitu zat dalam bentuk larutan dan zat yang tampak berwarna maupun berwarna. Jenis spektroskopi UV-Vis terutama berguna untuk analisis kuantitatif langsung misalnya kromofor, nitrat, nitrit dan kromat sedangkan secara tak langsung misalnya ion logam transisi.
Langkah-langkah utama dalam analisa dengan sinar UV/Vis
a. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV/Vis
b. Harus dilakukan jika senyawa yang dianalisa tidak melakukan penyerapan didaerah UV/Vis.
c. Senyawa harus diubah menjadi bentuk lain yang dapat melakukan penyerapan pada daerah yang dimaksud. Misalnya mengubah menjadi berwarna atau tidak berwarna.
c. Pemilihan panjang gelombang agar diperoleh panjang gelombang maksimum
d. Pembuatan kurva kalibrasi. Untuk keperluan ini dibuat sejumlah larutan standart dengan berbagai konsentrasi.
d. Absorbans larutan standart ini diukur kemudian dibuat grafik A versus C.
d. Hukum Lambert-Beer terpenuhi, jika grafik berbentuk garis lurus yang melalui titik nol
e. Pengukuran dilakukan pada kondisi yang sama seperti pada larutan standart.
Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Sedangkan peralatan yang digunakan dalam spektrofometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron yang ada pada atom ataupun molekul yang bersangkutan.
Sinar atau cahaya yang berasal dari sumber tertentu disebut juga sebagai radiasi elektromagnetik. Radiasi elektromagnetik yang dijumpai dalam kehidupan sehari-hari adalah cahaya matahari. Radiasi elektromagnetik ini memiliki sifat ganda yang disebut sebagai sifat dualistik cahaya yaitu sebagai gelombang dan sebagai partikel-partikel energi yang disebut foton. Karena sifat tersebut maka beberapa parameter perlu diketahui misalnya panjang gelombang, frekuensi dan energi tiap foton. Hubungan dari ketiga parameter di atas dirumuskan oleh Planck yang dikenal dengan persamaan Planck.
Hubungan antara panjang gelombang frekuensi dapat dirumuskan sebagai
c = λ . v atau λ = c/v atau v = c/λ
Persamaan Planck: hubungan antara energi tiap foton dengan frekuensi
E = h . v
E = h . c/ λ
dimana
E = energi tiap foton
h = tetapan Planck (6,626 x 10-34 J.s),
v = frekuensi sinar
c = kecepatan cahaya (3 x 108 m.s-1).
Dari rumus di atas dapat diketahui bahwa energi dan frekuensi suatu foton akan berbanding terbalik dengan panjang gelombang tetapi energi yang dimiliki suatu foton akan berbanding lurus dengan frekuensinya. Misalnya energi yang dihasilkan cahaya UV lebih besar dari pada energi yang dihasilkan sinar tampak. Hal ini disebabkan UV memiliki panjang gelombang (λ) yang lebih pendek (100–400 nm) dibanding panjang gelombang yang dimiliki sinar tampak (400–800 nm).
Berbagai satuan energi beserta faktor konversinya dapat dilihat pada tabel:
Erg Joule Kalori l.atm E.volt
1 erg = 1 10-7 2,3901×10-8 9,8687×1010 6,2418×1011
J joule = 107 1 2,3901×10-1 9,8687×10-3 6,2418×1018
1 kalori 4,1849×107 4,1840 1 4,1291×10-2 2,6116×1019
1 atm = 1,0133×109
1,0133×102 24,218 1 16,6248×1020
1 E.volt = 1,6021×10-12 1,6021x-19 3,8291×10-20 1,5611×10-20
1
Interaksi antara materi dengan cahaya disini adalah terjadi penyerapan cahaya, baik cahaya Uv, Vis maupun Ir oleh materi sehingga spektrofotometri disebut juga sebagai spektroskopi absorbsi. Berdasarkan rentang panjang gelombang dimana suatu zat menyerap gelombang elektomagnetik, spektrofotometri dapat digolongkan menjadi:
1. Spektrofotometri Vis (Visible) dengan panjang gelombang: 400-800 nm.
2. Spektrofotometri UV (Ultra Violet) dengan panjang gelombang: 100-400 nm.
3. Spektrofotometri UV-Vis dengan panjang gelombang: 100-800 nm.
4. Spektrofotometri IR (Infra Red) dengan panjang gelombang: 300-25.000 nm dan tidak dibahas disini.
Selain 4 spektrofotometri ini masih terdapat beberapa spektroskopi absorbsi lain yakni: spektroskopi absorbsi sinar x, Spektroskopi Gelombang Mikro, Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti (NMR), Spektroskopi Resonansi Spin elektron (ESR) dan Spektroskopi “Photoacoustic” tetapi tidak dibahas pada artikel ini.
Dari 4 jenis spektrofotometri ini (UV, Vis, UV-Vis dan Ir) memiliki prinsip kerja yang sama yaitu “adanya interaksi antara materi dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu”. Perbedaannya terletak pada panjang gelombang yang digunakan. Instrumen dari keempat spektrofotometri inipun tidak berbeda, yakni terdiri dari:
Fungsi masing-masing bagian
1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan berbagai macam rentang panjang gelombang.
2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis. Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalan gratting atau lensa prisma dan filter optik. Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi spektrum cahaya. Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya yang diteruskan sesuai dengan warnya lensa yang dikenai cahaya.
3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel yang telah di masukan ke dalam kuvet yang terbuat dari kuarsa atau palstik.
4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi arus listrik.
5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang berasal dari detektor.
Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri
Di dalam suatu molekul yang memegang peranan penting adalah elektron valensi dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu materi. Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi), berputar (rotasi) dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi.
Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis) mengenai suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja yang akan diserap.
Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan elektron dari keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini disebut transisi elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya inframerah maka elektron yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada suatu molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi). Sedangkan gerakan berputar elektron terjadi pada energi yang lebih rendah lagi.
Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi suatu suatu yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel sampel disinari dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. ketika cahaya mengenai sampel sebagian akan diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian lagi akan diteruskan. Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang mengenai permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang dapat diukur adalah It/I0 atau I0/It. Proses penyerapan cahaya oleh suatu zat dapat digambarkan sebagai berikut:
Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang hamburkan diukur sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambert-beer atau Hukum Beer, berbunyi: jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan.
Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk menghitung banyaknya cahaya yang hanburkan:
dan absorbansi dinyatakan dengan rumus:
dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah intensitas cahaya setelah melewati sampel. Hukum beer dapat ditulis sbegai:
A= a . b . c atau A = ε . b . c
dimana:
A = absorbansi
b atau l = tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga umumnya 1 cm)
c = konsentrasi larutan yang diukur.
ε = tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam molar)
a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam ppm).
Secara eksperimen hukum Lambert-beer akan terpenuhi apabila peralatan yang digunakan memenuhi kriteria-kriteria berikut:
1. sinar yang masuk atau sinar yang mengenai sel sampel berupa sinar dengan dengan panjang gelombang tunggal (monokromatis).
2. Penyerapan sianr oleh suatu molekul yang ada di dalam larutan tidak dipengaruhi oleh molekul yang lain yang ada bersama dalam satu larutan.
3. Penyerapan terjadi di dalam volume larutan yang luas penampang (tebal kuvet) yang sama.
4. Penyerapan tidak menghasilkan pemancaran sinar pendafluor.
5. Indeks reflaksi larutan tidak tergantung pada konsentrasi. Dimana hukum lamber-beer tidak berlaku untuk larutan dengan konsentrasi tinggi.
Spektrofotometri sinar tampak (Visible)
Spektrofotometri visible disebut juga spektrofotometri sinar tampak. Yang dimaksud sinar tampak adalah sinar yang dapat dilihat oleh mata manusia. Cahaya yang dapat dilihat oleh mata manusia adalah cahaya dengan panjang gelombang 400-800 nm dan memiliki energi sebesar 299–149 kJ/mol.
Elektron pada keadaan normal atau berada pada kulit atom dengan energi terendah disebut keadaan dasar (ground-state). Energi yang dimiliki sinar tampak mampu membuat elektron tereksitasi dari keadaan dasar menuju kulit atom yang memiliki energi lebih tinggi atau menuju keadaan tereksitasi.
Cahaya yang diserap oleh suatu zat berbeda dengan cahaya yang ditangkap oleh mata manusia. Cahaya yang tampak atau cahaya yang dilihat dalam kehidupan sehari-hari disebut warna komplementer. Misalnya suatu zat akan berwarna orange bila menyerap warna biru dari spektrum sinar tampak dan suatu zat akan berwarna hitam bila menyerap semua warna yang terdapat pada spektrum sinar tampak. Untuk lebih jelasnya perhatikan tabel berikut.
Panjang gelombang (nm) Warna warna yang diserap Warna komplementer
400 – 435 Ungu Hijau kekuningan
435 – 480 Biru Kuning
480 – 490 Biru-kehijauan Jingga
490 – 500
Hijau kebiruan Merah
500 – 560 Hijau Ungu kemerahan
560 – 580 Hijau kekuningan Ungu
580 – 595 Kuning Biru
595 – 610 Jingga Biru kehijauan
610 – 800 Merah Hijau kebiruan
Pada spektrofotometer sinar tampak, sumber cahaya biasanya menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram. Wolfram merupakan salah satu unsur kimia, dalam tabel periodik unsur wolfram termasuk golongan unsur transisi tepatnya golongan VIB atau golongan 6 dengan simbol W dan nomor atom 74. Wolfram digunakan sebagai lampu pada spektrofotometri tidak terlepas dari sifatnya yang memiliki titik didih yang sangat tinggi yakni 5930 °C.
Panjang gelombang yang digunakan untuk melakukan analisis adalah panjang gelombang dimana suatu zat memberikan penyerapan paling tinggi yang disebut λmaks. Hal ini disebabkan jika pengukuran dilakukan pada panjang gelombang yang sama maka data yang diperoleh makin akurat atau kesalahan yang muncul makin kecil.
Berdasarkan hukum Beer absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi, karena b atau l harganya 1 cm dapat diabaikan dan ε merupakan suatu tetapan . Artinya konsentrasi makin tinggi maka absorbansi yang dihasilkan makin tinggi, begitupun sebaliknya konsentrasi makin rendah absorbansi yang dihasilkan makin rendah.
Hubungan antara absorbansi terhadap konsentrasi akan linear (A≈C) apabila nilai absorbansi larutan antara 0,2-0,8 (0,2 ≤ A ≥ 0,8) atau sering disebut sebagai daerah berlaku hukum Lambert-Beer. Kurva kalibarasi hubungan antara absorbansi versus konsentrasi dapat dilihat pada Gambar.
Gambar Kurva hubungan absorbansi vs konsentrasi
Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri sinar tampak adalah zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut harus tampak berwarna. Jika tidak berwarna maka larutan tersebut harus dijadikan berwarna dengan cara memberi reagen tertentu yang spesifik. Reagen ini disebut reagen pembentuk warna. Berikut adalah sifat-sifat yang harus dimiliki oleh reagen pembentuk warna:
1) Kestabilan dalam larutan. Pereaksi-pereaksi yang berubah sifatnya dalam waktu beberapa jam, dapat menyebabkan timbulnya semacam cendawan bila disimpan. Oleh sebab itu harus dibuat baru dan kurva kalibarasi yang baru harus dibuat saat setiap kali analisis.
2) Pembentukan warna yang dianalisis harus cepat.
3) Reaksi dengan komponen yang dianalisa harus berlangsung secara stoikiometrik.
4) Pereaksi tidak boleh menyerap cahaya dalam spektrum dimana dilakukan pengukuran.
5) Pereaksi harus selektif dan spesifik (khas) untuk komponen yang dianalisa, sehingga warna yang terjadi benar-benar merupakan ukuran bagi komponen tersebut saja.
6) Tidak boleh ada gangguan-gangguan dari komponen-komponen lain dalam larutan yang dapat mengubah zat pereaksi atau komponen komponen yang dianalisa menjadi suatu bentuk atau kompleks yang tidak berwarna, sehingga pembentukan warna yang dikehandaki tidak sempurna.
7) Pereaksi yang dipakai harus dapat menimbulkan hasil reaksi berwarna yang dikehendaki dengan komponen yang dianalisa, dalam pelarut yang dipakai.
Setelah larutan ditambahkan reagen atau zat pembentuk warna maka larutan tersebut harus memiliki lima sifat di bawah ini:
1) Kestabilan warna yang cukup lama guna memungkinkan pengukuran absorbansi dengan teliti. Ketidakstabilan, yang mengakibatkan menyusutnya warna larutan (fading), disebabkan oleh oksidasi oleh udara, penguraian secara fotokimia, pengaruh keasaman, suhu dan jenis pelarut. Namun kadang-kadang dengan mengubah kondisi larutan dapat diperoleh kestabilan yang lebih baik.
2) Warna larutan yang akan diukur harus mempunyai intensitas yang cukup tinggi (warna harus cukup tua) yang berarti bahwa absortivitas molarnya (ε) besar. Hal ini dapat dikontrol dengan mengubah pelarutnya. Dalam hal ini dengan memilih pereaksi yang memiliki kepekaan yang cukup tinggi.
3) Warna larutan yang diukur sebaiknya bebas daripada pengaruh variasi-variasi kecil kecil dalam nilai pH, suhu maupun kondisis-kondisi yang lain.
4) Hasil reaksi yang berwarna ini harus larut dalam pelarut yang dipakai.
5) Sitem yang berwarna ini harus memenuhi Hukum Lambert-Beer.
Spektrofotometri UV (ultraviolet)
Spektrofotometri UV dengan pangjang gelombang 100-400 nm. Sinar ultra violet terbagi menjadi dua jenis yaitu ultraviolet jauh dan ulta violet dekat. Ultraviolet jauh memiliki rentang panjang gelombang ± 10 nm-200 nm, sedangkan ultra violet dekat memiliki rentang panjang gelombang ± 200-380 nm. Cahaya UV tidak bisa dilihat oleh manusia, namun beberapa hewan, termasuk burung, reptil, dan serangga seperti lebah dapat melihat sinar pada panjang gelombang UV.
Pada spektrofotometer UV biasanya menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen sebagai sumber cahaya. Deuterium merupakan salah satu isotop hidrogen yang memeiliki 1 proton dan 1 neutron namun tidak memiliki. Deuterium berbeda dengan hidrogen yang hanya memiliki 1 neutron tanpa proton.
Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri UV adalah zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut tidak tampak berwarna. Jika zat tersebut berwarna maka perlu direaksikan dengan reagen tertentu sehingga dihasilkan suatu larutan tidak berwarna. Namun biasanya zat yang berwarna lebih banyak dianalisis menggunakan spektrofotometri sinar tampak.
Analisis menggunakan sir ultraviolet biasanya dilakukan menggunakan ultraviolet dekat, sedangkan analisis menggunakan ultraviolet jauh maka instrumen yang digunakan harus dalam keadaan vakum. Hal ini disebabkan jika digunakan ultraviolet jauh maka udara akan ikut menyerap panjang gelombang yang digunakan. Akbatnya kesalahan yang dilakukan makin fatal, karena jika udara ikut menyerap maka absorbansi yang dihasilkan akan makin besar, jika hal ini dihubungkan dengan hukum Lamber-Beer maka konsentrasi zat yang dianalisis lebih tinggi dari yang seharusnya.
Spektrofotometri UV-Vis
Sesuai dengan namanya spektrofotometer UV-Vis merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Pada spektrofotometer UV-Vis menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda yakni sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible.
Kini spektrofotometer yang digunakan hanya menggunakan satu lampu sebagai sumber cahaya. Lampu yang digunakan sebagai sumber cahaya yaitu photodiode yang telah dilengkapi monokromator. Monokromator disini berfungsi untuk mengubah cahaya yang berasal dari sumber cahaya sehingga diperoleh cahaya hanya dengan satu jenis panjang gelombang.
Zat yang dapat dianalisis dengan spektrofotometri UV-Vis yaitu zat dalam bentuk larutan dan zat yang tampak berwarna maupun berwarna. Jenis spektroskopi UV-Vis terutama berguna untuk analisis kuantitatif langsung misalnya kromofor, nitrat, nitrit dan kromat sedangkan secara tak langsung misalnya ion logam transisi.
Langkah-langkah utama dalam analisa dengan sinar UV/Vis
a. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV/Vis
b. Harus dilakukan jika senyawa yang dianalisa tidak melakukan penyerapan didaerah UV/Vis.
c. Senyawa harus diubah menjadi bentuk lain yang dapat melakukan penyerapan pada daerah yang dimaksud. Misalnya mengubah menjadi berwarna atau tidak berwarna.
c. Pemilihan panjang gelombang agar diperoleh panjang gelombang maksimum
d. Pembuatan kurva kalibrasi. Untuk keperluan ini dibuat sejumlah larutan standart dengan berbagai konsentrasi.
d. Absorbans larutan standart ini diukur kemudian dibuat grafik A versus C.
d. Hukum Lambert-Beer terpenuhi, jika grafik berbentuk garis lurus yang melalui titik nol
e. Pengukuran dilakukan pada kondisi yang sama seperti pada larutan standart.
Komentar
Posting Komentar